如何在RT-PCR過程中避免DNA污染？ 用arcticzymes公司Heat＆Run gDNA去除試劑盒

PCR主混合物的去污

PCR是在研究和診斷中檢測(cè)DNA存在的靈敏方法。PCR中使用的聚合酶經(jīng)常被大腸桿菌  DNA 污染  。當(dāng)靶向少量細(xì)菌DNA時(shí)，污染的DNA可能會(huì)導(dǎo)致靈敏度降低和假陽(yáng)性。其他污染源可能是dNTP，緩沖液成分和引物/探針，以及在處理過程中引入的DNA。細(xì)菌的檢測(cè)和分型可以通過使用針對(duì)保守區(qū)域（即16S或23S rDNA基因）的寬范圍引物進(jìn)行。該方法對(duì)細(xì)菌DNA污染非常敏感，在大多數(shù)預(yù)混液和聚合酶中都可以發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DNA的痕跡。當(dāng)使用qPCR檢測(cè)或定量少量細(xì)菌DNA時(shí)，會(huì)污染  大腸桿菌 DNA可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

Master mix AMaster mix BMaster mix CMaster mix DMaster mix EMaster mix F5101520253035404501,0002,0003,0004,0005,0006,000CyclesFluorescence (dR)

圖1：通過使用水代替模板（NTC）并按照制造商的說明對(duì)來自不同供應(yīng)商的2x探針預(yù)混合物中大腸桿菌23S DNA的存在進(jìn)行了定量。該圖顯示了來自幾個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的圖。在所有測(cè)試的預(yù)混物中都發(fā)現(xiàn)了痕量的大腸桿菌23S DNA，Cq值通常在30-35之間。

為了解決這個(gè)問題，我們開發(fā)了一種簡(jiǎn)單而又準(zhǔn)確的  PCR去污試劑盒  ，該試劑盒可去除主混合物中的污染DNA，而不會(huì)降低PCR靈敏度

PCR Decontamination Kit

PCR去污試劑盒

PCR去污試劑盒可去除PCR預(yù)混液中的污染DNA，而不會(huì)降低PCR靈敏度。

• dsDNase的雙鏈特異特性允許使用引物和探針進(jìn)行去污染。
• 高效用于終點(diǎn)PCR和基于探針的qPCR。
• 污染的細(xì)菌DNA降至檢測(cè)極限以下的水平。
• 快速簡(jiǎn)便的協(xié)議。

在不降低靈敏度的情況下對(duì)母料進(jìn)行去污一直是一個(gè)挑戰(zhàn)。尤其是當(dāng)靶向少量DNA時(shí)，污染DNA是一個(gè)主要問題。由去污方案在qPCR分析中造成的任何靈敏度損失都是不可接受的。

協(xié)議

1. 將引物和探針與主要混合物和試劑盒內(nèi)容混合
2. 在37°C下孵育20分鐘
3. 在60°C下失活20分鐘
4. 添加模板并運(yùn)行qPCR

在存在DTT的情況下，dsDNase在60°C時(shí)不可逆地失活，從而確保失活后添加的任何模板都對(duì)消化沒有影響。

用于從20 µl反應(yīng)中去除污染性DNA的方案，但可以通過調(diào)整試劑盒內(nèi)容物的體積來按比例放大或縮小。

圖1： PCR去污試劑盒方案

500 pg untreated50 pg untreated5 pg untreated500 fg untreated50 fg untreatedNTC untreated500 pg decontaminated50 pg decontaminated5 pg decontaminated500 fg decontaminated50 fg decontaminatedNTC decontaminated5101520253035404502,5005,0007,50010,00012,50015,000Cycles

圖2：未經(jīng)處理和去污的qPCR 2x預(yù)混液用于以5步分析10倍的大腸桿菌gDNA連續(xù)稀釋液。包括NTC樣品，連續(xù)稀釋的所有圖均顯示三個(gè)重復(fù)的平均值。

使用PCR Decontamination Kit進(jìn)行處理不會(huì)降低PCR的敏感性。即使稀釋DNA，Cq水平也沒有明顯改變（圖2）。

套件內(nèi)容

• DTT（滅活援助）
• dsDNase（100個(gè)反應(yīng)）

儲(chǔ)存條件：儲(chǔ)存于-20?C。
樣品材料：該試劑盒可用于減少普通PCR和基于探針的qPCR混合物中的污染DNA。對(duì)于某些基于SYBR的qPCR混合物也很有效。
質(zhì)量控制：已  對(duì)試劑盒中是否存在RNase進(jìn)行了測(cè)試。

雙鏈特異性DNase

雙鏈特異性DNase（dsDNase）是*的雙鏈特異性核酸內(nèi)切酶。由于它們不消化ssDNA或RNA，因此可用于在其他核酸存在下特異性去除dsDNA。該酶是熱不穩(wěn)定的，因此使其成為必須使DNase失活的應(yīng)用的理想選擇。該酶有兩種版本，dsDNase和HL-dsDNase。

不含甘油和Triton FREE的版本

dsDNase和HL-dsDNase現(xiàn)在可用

物產(chǎn)

對(duì)雙鏈DNA的
特異性已對(duì)雙鏈和單鏈DNA和RNA寡核苷酸測(cè)試了核酸特異性。

使用具有5'處FAM和3'（Eurogentec）的FAM的15-mer寡核苷酸測(cè)量了dsDNase對(duì)底物的特異性。熒光與酶活性成正比。

測(cè)定條件：25 mM Tris pH 7.5、5 mM MgCl 2和2μM寡核苷酸。

相對(duì)活動(dòng)

從上面的數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，dsDNase是雙鏈特異性的。

dsDNase

熱失活
dsDNase可以通過在65°C下15分鐘或60°C下20分鐘的熱處理進(jìn)行熱滅活。該酶需要1 mM DTT和pH≥8才能*滅活。

技術(shù)指標(biāo)

• 單位定義
  一個(gè)單位定義為在100 mM醋酸鈉pH 5.0和5 mM MgCl2中使用50 µg / ml高分子量DNA在260 nm處的吸光度每分鐘增加0.001。
• 比
  活Ca。400 000 Kunitz單位/毫克
• 活性
  dsDNase在20-40°C的溫度范圍內(nèi)具有很高的活性。它至少需要2.5 mM Mg的活性，并具有7.5的pH。
• 儲(chǔ)存緩沖液
  20 mM Tris-HCl pH 7.5、2 mM MgCl2、10 mM NaCl，0.01％（v / v）Triton X-100、50％（v / v）甘油。
• 純度
  dsDNase被純化至明顯的同質(zhì)性。
• 儲(chǔ)存
  -20°C時(shí)，小儲(chǔ)存期限為3年。在4°C下可以保存至少6個(gè)月。該酶還耐受多個(gè)凍融循環(huán)。

HL-dsDNase

熱失活
HL-dsDNase可通過在58°C下5分鐘的熱處理進(jìn)行熱失活。該酶需要1 mM DTT和pH≥8才能*滅活。

技術(shù)指標(biāo)

• 單位定義
  一個(gè)單位定義為在100 mM乙酸鈉pH 5.0和5 mM MgCl2中使用50μg/ ml高分子量DNA在260 nm處的吸光度每分鐘增加0.001。
• 比
  活Ca。200 000 Kunitz單位/毫克
• 活性
  HL-dsDNase在20-40°C的溫度范圍內(nèi)具有很高的活性。它至少需要2.5 mM Mg的活性，并具有7.5的pH。
• 儲(chǔ)存緩沖液
  20 mM Tris-HCl pH 7.5、2 mM MgCl2、10 mM NaCl，0.01％（v / v）Triton X-100、50％（v / v）甘油。
• 純度
  HL-dsDNase被純化至明顯的同質(zhì)性。
• 儲(chǔ)存
  -20°C時(shí)，小儲(chǔ)存期限為2年。該酶還耐受多個(gè)凍融循環(huán)。

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