膠體金在快速檢測(cè)中的地位

優(yōu)良的穩(wěn)定性、靈敏度、度及制造過程中的可重復(fù)性，使得膠體金適合基于膜的檢測(cè)技術(shù)。

快速膜檢測(cè)需求廣泛，可應(yīng)用于諸多領(lǐng)域（見下表）。隨著靈敏度和特異性的提升，大量的潛在應(yīng)用可能是作為替代昂貴儀器檢測(cè)方法的低成本選擇。

快速檢測(cè)的應(yīng)用

這篇文章重點(diǎn)講述此種檢測(cè)方法中極為重要的組成部分—檢測(cè)標(biāo)記物的生產(chǎn)制造對(duì)整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的性能及可靠性的影響；尤其是強(qiáng)調(diào)了膠體金標(biāo)記物在此檢測(cè)功能中的優(yōu)勢(shì)。

什么是快速檢測(cè)？

快速檢測(cè)是一種廉價(jià)的、一次性的、 基于膜的檢測(cè)方法，它能提供分析物存在于液體樣品的視覺證據(jù)。這種檢測(cè)可以以獨(dú)立的試紙條，也可以以裝在塑料盒中的形式進(jìn)行。總的來說，做此項(xiàng)檢測(cè)至少只 需200ul的液體標(biāo)本，可在2至5分鐘內(nèi)完成。在臨床檢測(cè)中，樣品可能有尿、血液、血清、唾液或其他體液。

在非臨床檢測(cè)中，樣本可能是由土壤、粉塵、植物或者食品制備的微量溶液，它們同樣可以直接應(yīng)用膜試紙條檢測(cè)。這種檢測(cè)方法無需儀器操作，可應(yīng)用于臨床、實(shí)驗(yàn)室、室外或者家庭——通常為無操作經(jīng)驗(yàn)人員使用。

快速檢測(cè)法有兩種形式——層析和滲濾。層析是zui普通的形式因?yàn)槠渲圃旒笆褂枚急容^簡(jiǎn)易，這兩種形式所涉及的原理雖然相同，但我們這里將要討論的是層析檢測(cè)法。
一個(gè)快速檢測(cè)的底層一般是硝酸纖維素膜，在它上面固定了檢測(cè)蛋白，通常是抗體或抗原（圖1）。

圖1 側(cè)向?qū)游隹焖贆z測(cè)試紙條的結(jié)構(gòu)圖

連接著膜的是包含有干燥金標(biāo)的金標(biāo)墊（通常是玻璃 纖維）。對(duì)于目前大多數(shù)可做的檢測(cè)項(xiàng)目，這種結(jié)合墊含有吸附了針對(duì)待檢分析品的特異性抗體或抗原的金粒子。樣品墊通常為紙質(zhì)，附著著結(jié)合墊。當(dāng)使用樣品墊 時(shí)，液體樣品通過毛 細(xì)擴(kuò)散作用穿移過結(jié)合墊，再水化金交聯(lián)物，使待分析樣品與交聯(lián)物相互作用。然后金交聯(lián)物與待分析樣品復(fù)合物轉(zhuǎn)移至膜條帶上再移向蛋白結(jié)合物，復(fù)合物在此處 被固定后以一條細(xì)細(xì)的紅線的形式產(chǎn)生明顯的信號(hào)。第二條線是控制線，由余下的金交聯(lián)物形成于膜上，表明測(cè)試完成。

顧名思義，快速檢測(cè)應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)提供結(jié)果，準(zhǔn)確的說是在幾分鐘內(nèi)。這種檢測(cè)法必須方便、、可靠、廉價(jià)、是一次 性的而且操作簡(jiǎn)易的。它們也必須容易和清楚的說明書，甚至是沒有經(jīng)驗(yàn)的使用者也能操作。從生產(chǎn)廠家的觀點(diǎn)來看，這種快速檢測(cè)將會(huì)帶來巨大的附加值，且容易 向世界各地的使用者推廣，而無論使用者其有無此項(xiàng)檢測(cè)的經(jīng)驗(yàn)（見文后附言）。

快速檢測(cè)功能廣泛。改變抗體或者對(duì)條帶的化學(xué)配方作微小的變動(dòng)，同樣的設(shè)計(jì)應(yīng)能用于多種檢測(cè)。

為何使用金標(biāo)記？

早期的快速檢測(cè)使用有色膠乳形成可視信號(hào)，目前的某些檢測(cè)仍使用此手段。 過去和現(xiàn)在，乳膠法一直是凝集反應(yīng)主要的標(biāo)記方法，這是因?yàn)樗诮Y(jié)合成分的存在下易于凝集。對(duì)于快速檢測(cè)而言，交聯(lián)物的穩(wěn)定性是避免假陽性的關(guān)鍵，而易于凝集可能就是其產(chǎn)生假陽性的主要問題。

因?yàn)榫哂懈玫臐撛诜€(wěn)定性，20世紀(jì)80年代末，金標(biāo)記被引入膜快速檢測(cè)中。在適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)條件下，任何被大小的金顆粒都可以被重現(xiàn)性制造出來。 不同的大小可用于不同的用途。其優(yōu)良的穩(wěn)定性、敏感性、性及可重復(fù)生產(chǎn)性等特點(diǎn)使得金適合于在快速檢測(cè)中的應(yīng)用。金本性屬惰性元素，被適當(dāng)加工可形成 完整的球形顆粒。當(dāng)正確連接時(shí)，蛋白質(zhì)能牢固地結(jié)合在金顆粒表面，無論是液態(tài)或固態(tài)都能保持長(zhǎng)久的穩(wěn)定性。而且，若是在制造過程中蛋白被固定，其與金 交聯(lián)物的非特異性結(jié)合可被減至零。

標(biāo)記抗體和抗原的不同標(biāo)記物優(yōu)缺點(diǎn)的比較如表1所示：

表1.快速檢測(cè)中常用標(biāo)記物的特征比較

膠體金的制造

當(dāng)膠體金被大量生產(chǎn)時(shí)，為保證批間重復(fù)性及避免不穩(wěn)定性，成熟的工藝方法是必須的。為獲得zui終穩(wěn)定敏感的產(chǎn)品，生產(chǎn)100升高質(zhì)量的膠體金就需要極度的細(xì)心與仔細(xì)以獲得zui終穩(wěn)定及高靈敏度的產(chǎn)品。在生產(chǎn)過程中的每一步都需要使用電鏡檢查來進(jìn)行質(zhì)量控制。

圖２　金離子還原形成金顆粒

在過去的20年里，生產(chǎn)商們引進(jìn)了各種不同的方法來合成膠體金，目的就是為了獲得直徑一定且均一的單分散性的膠體。盡管所有的生產(chǎn)方法都是依賴于還 原HAuCl4來形成金原子，但其物理?xiàng)l件還是有相當(dāng)大的差異，如反應(yīng)物添加的次序、還原劑使用的多寡、以及zui終生產(chǎn)出的膠體的質(zhì)量（大小、形狀、變異系 數(shù)等）。

大體來說，所有的生產(chǎn)方法都是使用還原劑提供電子給溶液中帶正電荷的金離子而產(chǎn)生金原子，如下所示：

氯金酸＋還原劑＝膠體金

HAuCl4 + e– = Au0

通常使用的還原劑包括檸檬酸鈉、黃磷、硼氫化鈉、硫氰酸鈉。圖２所示為不同離子水平還原過程。

在加入還原劑之前，溶液中所含為100%金離子。曲線的縱坐標(biāo)代表在加入還原劑時(shí)金離子轉(zhuǎn)變?yōu)榻鹪拥倪M(jìn)程。加入還原劑之后，溶液中金原子的含量立 即出現(xiàn)急劇的上升，直到其達(dá)到過飽和。緊接著在一個(gè)被稱作核化的過程中發(fā)生凝集作用，在核化位點(diǎn)形成由11個(gè)金原子構(gòu)成的中央的二十面體金核心。核化位點(diǎn) 的形成是為了減少溶液中金原子的過度飽和，其形成極其迅速。此過程一旦完成，溶液中剩余的金原子在遞減的能量梯度下繼續(xù)結(jié)合核化位點(diǎn)直到所有的原子從溶液 中移除。

zui初形成的核數(shù)目決定了zui終將有多少顆粒形成于溶液中，而這個(gè)數(shù)目又反過來取決于所加入的還原劑的量。還原劑越多產(chǎn)生的晶核越多從而產(chǎn)生的金顆粒也 越多。顯而易見，在一個(gè)含既定數(shù)目氯化金的溶液中，形成的核化位點(diǎn)的數(shù)目越多，zui終形成的每個(gè)金顆粒的尺寸就越小。因而微粒的大小可通過所加入的還原劑的 量來精細(xì)調(diào)控。如果生產(chǎn)條件經(jīng)過優(yōu)化，所有的核化位點(diǎn)都可以在瞬間同時(shí)發(fā)生，使得所形成的金顆粒大小都*一致（即單分散型）。要做到這一點(diǎn)是很困難的。 大多數(shù)的生產(chǎn)方法都無法使所有金離子于瞬間同時(shí)得到還原并形成核化位點(diǎn)，從而造成核化過程的不均一及多分散性膠體的產(chǎn)生，zui終導(dǎo)致產(chǎn)品的重復(fù)性低下、交聯(lián) 物不穩(wěn)定。

圖3 被包繞雙電子層的膠體金顆粒

每個(gè)膠體金粒周圍都包繞著來源于溶液中殘留陰離子的負(fù)電荷層的金顆粒懸液構(gòu)成（見圖3），這種被稱作zeta電位的電子層使得金顆粒之間相互排斥并在懸浮液中任意分布。zeta電位可以通過改變周圍溶液中離子的濃度而被壓縮或擴(kuò)張。

高質(zhì)量的膠體金和定制加工完好的交聯(lián)物方便用于商業(yè)用途，通過從信譽(yù)度較好的供應(yīng)商購買這些成分而非試圖自己加工大批量的金不僅可以節(jié)省生產(chǎn)廠家的時(shí)間還可以減少他們的制作風(fēng)險(xiǎn)。

好膠體金和不好的膠體金

膠體金及交聯(lián)物的生產(chǎn)制造表面看似簡(jiǎn)易，若掉以輕心則可導(dǎo)致生產(chǎn)出劣質(zhì)、性能差及重現(xiàn)性極差的產(chǎn)品進(jìn)而影響其商業(yè)用途。將這樣的產(chǎn)品應(yīng)用于快速檢測(cè) 中可能導(dǎo)致結(jié)果的低穩(wěn)定性、低敏感性及低特異性。為防止這樣的結(jié)果出現(xiàn)，應(yīng)使用透射電子顯微鏡（TEM）來評(píng)價(jià)膠體金的超細(xì)微結(jié)構(gòu)。這種檢測(cè)能使生產(chǎn)者對(duì) 照標(biāo)準(zhǔn)比較膠體的直徑，得到顆粒球狀、顆粒不規(guī)則性和顆粒直徑的變化。

圖4 膠體金與劣質(zhì)（不穩(wěn)定）膠體金

如果還原過程中核化作用及形成速度沒有得到很好控制，粒子的形成就會(huì)不均一。（見圖４），所見的粒子可能具有不同的大小及形狀（如橢圓形、三角形、 長(zhǎng)方形、菱形等等）。這樣的粒子在與蛋白的結(jié)合過程中將無法被均勻包被，也不能在溶液中均勻分布。zui終將影響產(chǎn)品的顏色、敏感性、特異性及穩(wěn)定性。僅僅 5%形狀不均一的粒子都會(huì)影響測(cè)試的結(jié)果，使其*不具重現(xiàn)性。與代表著制作精良的40nm的單分散性膠體粒子的櫻桃紅色相比，由“劣質(zhì)金”所形成的信號(hào) 常可見到淡藍(lán)色或紫色。雖然在檢測(cè)系統(tǒng)中白色背景膜上較暗的顏色更容易辨別，但暗示著潛在的不穩(wěn)定性，而這種不穩(wěn)定性更容易造成錯(cuò)誤的結(jié)果。更嚴(yán)重的是， 粒子形狀及尺寸的不均一會(huì)導(dǎo)致蛋白包被的不均一，這樣會(huì)導(dǎo)致交聯(lián)物長(zhǎng)時(shí)間的積聚與凝集，儲(chǔ)存于溶液中的交聯(lián)物可能于幾天甚至幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就出現(xiàn)這樣的變化。

即使立即將交聯(lián)物干燥于固相基質(zhì)上也無法*克服這個(gè)問題，在干燥過程中，由于粒子形狀而未穩(wěn)定結(jié)合的表面蛋白很容易分離，造成假陽性及高背景。

快速檢測(cè)操作過程中一個(gè)zui常見的問題就是金交聯(lián)物不能以適當(dāng)?shù)乃俣燃巴暾问綇牟ＡЮw維結(jié)合墊上釋放，這個(gè)問題常常是因?yàn)槲?包被的金顆粒直接暴 露在玻璃纖維材料上而不能釋放。這必然意味著表面蛋白或者*地附著在纖維基質(zhì)上或離開金顆粒自由飄浮。開始就具備包被均一的單分散性球形粒子再加上制備 完好的金交聯(lián)物，可大大減少這種危險(xiǎn)問題的發(fā)生。

盡管TEM檢測(cè)是決定膠體質(zhì)量的*正確方法，但鑒定膠體或交聯(lián)物是否包含融合的、凝集的或者不均一粒子亦或含有不同大小粒子群體的快速方法就是目 測(cè)它的顏色。的40nm（診斷應(yīng)用中zui常使用的粒子大小）的膠體應(yīng)該顯示櫻桃紅色。如果膠體或交聯(lián)物出現(xiàn)紫色，很有可能說明其質(zhì)量低劣且不穩(wěn)定。

金顆粒大小的選擇

圖5：因優(yōu)化信號(hào)選擇金粒子的大小

檢測(cè)信號(hào)是由金顆粒聚集于測(cè)試線或控制線而出現(xiàn)的信號(hào)。這些粒子必須足夠大到能被看見，粒子的尺寸越大，這些粒子聚集后就越容易被看見。例如1nm 直徑的粒子，無論其聚集數(shù)量多少幾乎都是不可能被看見的，因?yàn)?nm的粒子沒有更大粒子所具有的亮紅色。只有直徑達(dá)到20nm的粒子才會(huì)出現(xiàn)可見的信號(hào)。 隨著粒子尺寸的增大，位阻現(xiàn)象又成了一個(gè)問題（見圖5）。例如，如果IgG（160，000道爾頓）分子僅僅8nm長(zhǎng)，大約4nm從金顆粒表面伸展開，那 么，100nm的粒子將會(huì)使這些小的表面分子顯得更小而很難與特異性的蛋白相互作用。此外，這些粒子的尺寸越大，它們?cè)诩榷w積溶液中存在的數(shù)量越小。

這種可見度的需要與位阻現(xiàn)象之間的矛盾現(xiàn)象表明，對(duì)于大多數(shù)的免疫檢測(cè)應(yīng)用而言，zui適的粒子大小是40nm.在某些情況下當(dāng)位阻現(xiàn)象成為較大問題時(shí) （如針對(duì)較小的抗原），20nm的粒子則更為合適；當(dāng)希望出現(xiàn)更深顏色或當(dāng)分子表面較低的曲率提高了抗原抗體分子間的交互作用，較大一點(diǎn)的粒子則更為可 取。應(yīng)該由實(shí)驗(yàn)決定確定多少顆粒大小能帶來高靈敏度、淺背景色和高穩(wěn)定性。

膠體金的制造

制造者必須了解讓他們的蛋白與膠體金持久結(jié)合的物理及化學(xué)進(jìn)程，具備了這些知識(shí)之后，要進(jìn)行從小批量制造到大規(guī)模生產(chǎn)就變得輕而易舉，而無須以犧牲 產(chǎn)品的敏感性、穩(wěn)定性、特異性或重現(xiàn)性為代價(jià)了。僅僅把交聯(lián)物揉合到一起，雖然成本低廉且簡(jiǎn)易，卻通常會(huì)導(dǎo)致聚集體的形成。通過TEM可以觀察到，每一個(gè) 聚集體都是由4個(gè)或更多金交聯(lián)物分子組成的群體。這種聚集體的存在通常預(yù)示著產(chǎn)品的不穩(wěn)定性，其性能會(huì)隨著時(shí)間而改變。雖然比較未聚集的產(chǎn)品剛開始具有更 高的靈敏度，但這些產(chǎn)品很快會(huì)出現(xiàn)穩(wěn)定性和特異性的問題。

一種好的交聯(lián)物表現(xiàn)為蛋白吸附于金的表面上，與膠乳不同的是，蛋白是被動(dòng)地吸附于交聯(lián)物表面，因而不會(huì)出現(xiàn)共價(jià)結(jié)合。然而，由于某些小分子與金表面 沒有足夠的結(jié)合位點(diǎn)；像激素、藥物及其他小分子（<10KD）在被動(dòng)交聯(lián)之前必須先結(jié)合到大分子載體上，多為BSA.在任何情況下，位阻現(xiàn)象都會(huì)阻 礙小分子升至zeta電位。載體應(yīng)該是惰性的，這樣就不會(huì)影響檢測(cè)蛋白質(zhì)的活性。

抗體的Fc片段緊緊吸附在金顆粒表面上，這樣圍繞著金顆粒的雙電子層表面的Fab片段就突出在外面，這樣Fab就能吸附分析物（見圖6）。膠體金上 標(biāo)記抗體時(shí)，不能有過量的待標(biāo)記抗體存在。因?yàn)檫^量的游離的抗體會(huì)跟膠體金上的抗體與抗原發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性，而且過量的抗體蛋白會(huì)影響到標(biāo)記 物的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)和膠體金結(jié)合的*條件在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。

蛋白通過以下機(jī)制于幾秒之內(nèi)吸附于金表面：

圖6 抗體與金粒子的結(jié)合力

（1） 金粒子所帶負(fù)電荷與蛋白內(nèi)氨基酸（如賴氨酸）所帶陽性電荷的zui初的相互吸引

（2）蛋白通過某些氨基酸殘基包括色氨酸與金粒子表面之間的疏水吸附作用

（3）蛋白中的半胱氨酸的硫基與金粒子間的配價(jià)結(jié)合

交聯(lián)物的穩(wěn)定

隨著特異蛋白的結(jié)合，交聯(lián)物必須用適當(dāng)?shù)脑噭┻M(jìn)行穩(wěn)定，通常使用BSA、明膠、PEG（聚乙二醇）或酪蛋白。使用穩(wěn)定劑有雙重功能，一是它可通過封閉膠體表面未和特異性蛋白結(jié)合的位點(diǎn)而減少了非特異性反應(yīng)；二是它可有助于更穩(wěn)定的懸液的形成。

一旦結(jié)合，金即被調(diào)整至預(yù)期的濃度，并混懸于相應(yīng)的緩沖液中。這種緩沖液應(yīng)可使液體交聯(lián)物穩(wěn)定，商業(yè)生產(chǎn)者常會(huì)使用低摩爾濃度緩沖液以使得工業(yè)客戶 能簡(jiǎn)單重懸交聯(lián)物于自己所選的緩沖液中。總的來說，zui終的儲(chǔ)存緩沖液不應(yīng)含有高鹽緩沖液和表面活性劑，因?yàn)樗鼈冇锌赡芡ㄟ^水解或置換抗體造成損傷。含有硫 基或汞的防腐劑會(huì)造成交聯(lián)物的*毀壞。膠體金zui常用的防腐劑為0.1%疊氮化合物。

專業(yè)制作出的膠體金的儲(chǔ)藏幾乎是無限期的。通過計(jì)算有多少結(jié)合劑可吸附到金粒子的表面，可能會(huì)減少批間差，其形成的交聯(lián)物比單獨(dú)的抗體可更長(zhǎng)久的儲(chǔ)存；恰當(dāng)干燥于固相組分的金標(biāo)蛋白則可保存數(shù)年之久。

膠體金的大規(guī)模制造

盡管已經(jīng)有技術(shù)及科學(xué)的資料來描述出簡(jiǎn)單的小量膠體金和交聯(lián)物的生產(chǎn)過程，但應(yīng)用于大批量商業(yè)生產(chǎn)（譬如100升的量）時(shí)的方法仍舊存在著所有權(quán)的 問題。假設(shè)從氯金酸至膠體金的還原過程必須于微秒之內(nèi)完成，那么100升或更大量產(chǎn)品的生產(chǎn)則需要非常精細(xì)的技術(shù)而不是僅僅遵循著小量產(chǎn)品生產(chǎn)的同一原 則。

由于這些技術(shù)僅僅為用于商業(yè)生產(chǎn)的金交聯(lián)物企業(yè)中的專家所熟知，所以大多數(shù)生產(chǎn)者不會(huì)試圖在企業(yè)內(nèi)部選擇這種艱巨的任務(wù)生產(chǎn)大批量的膠體金。相反，快速檢測(cè)試劑的生產(chǎn)商會(huì)與膠體金專家合作，籍此來減少費(fèi)用的成本和失敗的危險(xiǎn)，同時(shí)也可以使得他們的產(chǎn)品盡快走向市場(chǎng)。

這樣的合作安排通常由生產(chǎn)商進(jìn)行內(nèi)部的實(shí)驗(yàn)開始，這些實(shí)驗(yàn)使用小量商業(yè)用途的膠體來決定何種抗體zui適于其應(yīng)用。隨后，一些企業(yè)內(nèi)部進(jìn)行更大量的膠體 交聯(lián)實(shí)驗(yàn)來決定按比例放大10倍或100倍的產(chǎn)品是否能生產(chǎn)出相同質(zhì)量的交聯(lián)物。在提高溫度和應(yīng)用不同緩沖液以及干燥狀態(tài)下進(jìn)行此階段的嚴(yán)格的金交聯(lián)物穩(wěn) 定性實(shí)驗(yàn)操作是尤其重要的。質(zhì)量控制應(yīng)包括使用TEM檢查有關(guān)聚集產(chǎn)生的情況、光密度、敏感性及特異性。在進(jìn)行大批量快速檢測(cè)產(chǎn)品的生產(chǎn)之前，多批次地進(jìn) 行這種大量的實(shí)驗(yàn)來決定生產(chǎn)的重現(xiàn)性是很有必要的。

定量的可能性

大多數(shù)的快速檢測(cè)只是定性的，只能用于檢測(cè)臨床樣本中是否含有超過檢測(cè)濃度的特定生物成分存在。然而，有許多的檢測(cè)則需要一種定量的元素，例如監(jiān)控臨床指標(biāo)的變化或確定特定分析物的相對(duì)或濃度。

這樣的檢測(cè)包括三種形式，*種形式是，當(dāng)進(jìn)行測(cè)試時(shí)，許多內(nèi)在的信號(hào)可出現(xiàn)測(cè)試結(jié)果在視覺上的對(duì)比，這種測(cè)試僅僅能提供半定量的結(jié)果，結(jié)果可分為 陰性、弱陽性、中陽性和強(qiáng)陽性。第二種類型，檢測(cè)線的反應(yīng)劑設(shè)計(jì)成只能結(jié)合已知一定量的分析物，任何過量的分析物將會(huì)和下一條檢測(cè)線結(jié)合，產(chǎn)生一個(gè)溫度計(jì) 式的條帶梯度。

在第三種測(cè)試類型中，測(cè)試樣品所產(chǎn)生的信號(hào)由一個(gè)小型的、便攜式的分析儀讀取，并由分析儀將有色的測(cè)試線轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，許多這樣一般的條帶測(cè)試讀取儀將于近期應(yīng)用于商業(yè)用途。

金標(biāo)記尤其適合于這種定量或半定量的測(cè)試，因?yàn)闇y(cè)試產(chǎn)生的信號(hào)既又具有高度可重復(fù)性。大多數(shù)的信號(hào)是利用光電二極管通過反射標(biāo)定的刻度尺產(chǎn)生數(shù) 字，度取決于可被讀取得測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確程度以及測(cè)試條帶產(chǎn)生的可重現(xiàn)性信號(hào)的可靠程度。由于金標(biāo)記的度，相對(duì)于許多其他類型的標(biāo)記，其可產(chǎn)生的可 重現(xiàn)性信號(hào)具備更高的可靠性。

金標(biāo)信號(hào)的銀增強(qiáng)作用

無論以層析還是滲濾模的形式，快速檢測(cè)法通常都可提供與ELISA 試劑盒相似或更高的敏感性。對(duì)大多數(shù)的待分析物而言，檢測(cè)水平達(dá)到1ng/ml或更小的量是可能的。然而，也有許多待分析物對(duì)這種直接標(biāo)記系統(tǒng)無法達(dá)到足夠的敏感度。

要用肉眼在清晰背景的白色膜條上發(fā)現(xiàn)金產(chǎn)生的信號(hào)，其敏感度則要受到使用者能力的局限。使用光反射技術(shù)的定量方法常常無法達(dá)到人類肉眼視覺更大的敏 感性。使用銀來增強(qiáng)金標(biāo)記強(qiáng)度是一種有價(jià)值和前途的技術(shù)，它可獲得增加100倍的檢測(cè)敏感性。用這種方法將銀溶液應(yīng)用到測(cè)試線，來源于金標(biāo)記的初期信號(hào) （有時(shí)候是肉眼可見的）即可被增強(qiáng)。在應(yīng)用較小粒子（約5nm）的金交聯(lián)物的位置，使用這種間接方法可獲得更大的總體敏感性。通過在一步測(cè)試法中摻入銀試 劑就有可能無需任何其它步驟就使信號(hào)得到增強(qiáng)，這樣液體樣品的應(yīng)用便能推進(jìn)整個(gè)反應(yīng)的進(jìn)程（見圖7）。所有的反應(yīng)物（包括金交聯(lián)物及增強(qiáng)劑銀鹽）都被干燥 于測(cè)試條帶上僅由樣品溶開。

圖7層析快速檢測(cè)中銀對(duì)金標(biāo)

這種間接的增強(qiáng)技術(shù)有望在pg/ml的范圍內(nèi)對(duì)待分析物進(jìn)行檢測(cè)。被干燥后的反應(yīng)物是穩(wěn)定的并有可能在聚集之前被引入測(cè)試裝置中。由于敏感性的增 強(qiáng)，比目前用于直接標(biāo)記的測(cè)試系統(tǒng)中更小量的樣品也可被檢測(cè)出。鑒于銀的增強(qiáng)效果，使得為從前的交聯(lián)檢測(cè)法無法檢測(cè)出的待分析物而研究開發(fā)出基于金的一步 檢測(cè)法成為可能。

附言：

快速測(cè)試要求

基于膜上的快速檢測(cè)法可廣泛的應(yīng)用于臨床。雖然在臨床環(huán)境中大多數(shù)檢測(cè)是由專業(yè)的醫(yī)療保健人士操作，但越來越多的檢測(cè)方法被批準(zhǔn)由相對(duì)無經(jīng)驗(yàn)的家庭 使用者操作使用。為創(chuàng)造可成功應(yīng)用于這個(gè)特殊市場(chǎng)的快速檢測(cè)法，生產(chǎn)商必須為這些有或無經(jīng)驗(yàn)的使用者周全考慮。除此之外，生產(chǎn)商為了獲得加工處理的效率而 控制成本必須有自己的一套需求。以下是目前快速檢測(cè)產(chǎn)生的關(guān)鍵要求。

操作簡(jiǎn)易 或許操作上的簡(jiǎn)易是使得快速檢測(cè)在商業(yè)上可行的zui重要特色。一般而言，這種檢測(cè)都是應(yīng)用多功能且簡(jiǎn)單的生化技術(shù)而無需或僅需極小的操作經(jīng)驗(yàn)即可完成的。面向使用者、提高操作性簡(jiǎn)易性的特色包括一步操作法及測(cè)試結(jié)果易識(shí)別的特色。

樣品量小 臨床醫(yī)生和家庭使用者都鐘愛測(cè)試中僅需極少量樣品這一點(diǎn)，此特色具有眾多優(yōu)點(diǎn)：收集樣品時(shí)無需較多經(jīng)驗(yàn)，通常操作速度較快，給患者造成的潛在傷害及疼痛也會(huì)較少，同時(shí)還能減少浪費(fèi)。

快速 快速檢測(cè)正因這一點(diǎn)而得名。在許多臨床檢測(cè)應(yīng)用中會(huì)使用到快速檢測(cè)，速度是其根本。根據(jù)臨床醫(yī)生需求，這種檢測(cè)的理想目標(biāo)就是在3分鐘內(nèi)提供結(jié)果，而許多快速檢測(cè)都可滿足這種要求。

靈活 對(duì)大多數(shù)的檢測(cè)而言，若要滿足臨床醫(yī)生需要即時(shí)出結(jié)果就可能要以犧牲檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量為代價(jià)。對(duì)生產(chǎn)商而言，應(yīng)為快速檢測(cè)選擇那些可獲得定性、半定量、或者定量結(jié)果而無需大幅置換基底物或反應(yīng)物的理想的原材料。

臨床應(yīng)用 要使得快速檢能在臨床環(huán)境中得到廣泛應(yīng)用，它取得的結(jié)果必須可與臨床實(shí)驗(yàn)室儀器檢測(cè)所提供的相媲美。快速檢測(cè)的理想特征包括高敏感性（<%的假陰 性）、高特異性（<%的假陽性）及長(zhǎng)期穩(wěn)定性（12個(gè)月以上），結(jié)合良好的檢測(cè)設(shè)計(jì)，既有助于減少金交聯(lián)物的應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生的假陽性和假陰性，又能增加 測(cè)試（交聯(lián)物）的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，商業(yè)用途的金交聯(lián)物可達(dá)到長(zhǎng)達(dá)１２個(gè)月的穩(wěn)定性。

可靠性 快速檢測(cè)的發(fā)展造就了大量多樣化的測(cè)試片或試劑盒式檢測(cè)模式的產(chǎn)生，適用的環(huán)境范圍從緊急車輛到家庭環(huán)境不等。快速檢測(cè)除了對(duì)物理?xiàng)l件不能苛刻外，更要求 其能提供變異系數(shù)在5%或更小范圍內(nèi)的可靠結(jié)果。若嚴(yán)格地控制生產(chǎn)條件，金交聯(lián)物將有助于通過zui小化批量生產(chǎn)中的變異提升測(cè)試的可靠性。

低廉 欲用于臨床檢測(cè)的快速檢測(cè)遭到同臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)一樣全面降價(jià)的定價(jià)壓力；欲用于家庭使用的快速檢測(cè)又遭到同其他廠商相同產(chǎn)品的價(jià)格競(jìng)爭(zhēng)；面對(duì)這兩種情形，廠家必須面對(duì)每種測(cè)試結(jié)果都達(dá)到低成本的市場(chǎng)需求。

高附加值 為了能在以*的一次性快速檢測(cè)中獲利，生產(chǎn)商必須不斷生產(chǎn)以降低產(chǎn)品成本。理想的測(cè)試應(yīng)使用易獲取的高質(zhì)量的原材料，部件易于大量組裝，這樣才能達(dá)到原料及勞動(dòng)力成本均低廉。要取得這種平衡，原料和試劑則適于使用比手工操作優(yōu)勢(shì)大得多的自動(dòng)加工處理。

商業(yè)接受度 無論是由臨床中受過訓(xùn)練的專業(yè)醫(yī)療人士還是毫無經(jīng)驗(yàn)的家庭使用者使用，快速檢測(cè)的設(shè)計(jì)必須關(guān)注消費(fèi)者的可接受度。相比令操作者毫不費(fèi)力操作的產(chǎn)品，令人棘手的儲(chǔ)存及操作形式、難以識(shí)別的顏色都是產(chǎn)品難在商業(yè)上取得成功的弊端。

結(jié)語

當(dāng)乳膠普遍用于結(jié)合物時(shí)，快速檢測(cè)從20世紀(jì)80年代中期開始沒有太大的變化。但自那以后，由于在大量快速檢測(cè)法設(shè)計(jì)中對(duì)更高敏感性、可靠性及重現(xiàn)性要求的增加使得金作為交聯(lián)物的。

制作精良的金試劑無論以液體還是干燥形式存在都具有極大的穩(wěn)定性。如果繼續(xù)有對(duì)基于金的快速檢測(cè)有更大敏感性和特異性的需求，唯有對(duì)膠體金的生產(chǎn)和使用進(jìn)行嚴(yán)格的操作才有可能取得成功。

參考文獻(xiàn)

1、 J Chandler, Assay device and method, 96901447.1. European patent application, British Biocell International.

2、John Chandler, PhD, is the managing director, and Tracey Gurmin and Nicola Robinson are part of the custom consultancy team at BBInternational （Cardiff, Wales, UK）

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